Dagens laboration gick ut på att rena plasmider (innehållande pLL37 som insert) från värdbakteriernas övriga cellmaterial. Detta innefattar kromosomalt DNA, RNA, proteiner och övrigt celldebris (t.ex. cellväggen). Reningen innebar en alkalisk denaturering samt rening på glasfiberkolonn.
När plasmidlösningen till slut blivit "ren", testades renheten genom absorbansmätning med spektrofotometer.
Absorbansmaximum för DNA finnes vid 260 nanometer och detsamma för protein finnes vid 280 nanometer. Kvoten mellan dessa värden bör inte understiga 1,8 - gör den det kan en proteinförorening konstateras. OBS! En kvot som är större än 1,8 betyder dock inte att provet INTE kan innehålla föroreningar av annat än protein, som t.ex. kromosomalt DNA.
Vår (min och Alina del Portos) plasmidlösning gav kvoten:
A260/A280 = 1,83
Sannolikt innehåller då lösningen åtminstone inte några proteinföroreningar!
Med hjälp av absorbansen beräknades även DNA-koncentrationen i plasmidlösningen. En absorbansenhet motsvarar 50 µg/ml, vilket innebär att det värde på absorbansen som vi fått fram kan multipliceras med 50 för att få fram koncentrationen.
A260 = 0,075
c = 0,075 x 50 µg/ml = (0,075 x 50)/1000 µg/µl = 0,00375 µg/µl
Plasmidlösningen var dock spädd 100 gånger med TE-buffert, så detta speglar DNA-koncentrationen i spädningen. Ospädd plasmidlösning har koncentrationen:
c = 0,00375 x 100 µg/µl = 0,375 µg/µl
Hej!
SvaraRaderaFin blogg Camilla! Du är tydlig med vad som gäller och du håller dig inom frågorna som skall besvaras. I ditt resultat visar du beräkningar som gjorts och du har en bild över kurvan, BRA. Du skulle kunna diskutera lite mer kring din kurva och ditt resultat. Vad som skulle kunde vara anledningen till att man får en lägre absorbans än 260nm eller högre än 280nm. Hur pålitlig är absorbansmätning egentligen?
I det stora hela har du förstått vad det innebär att "blogga" :)
/ Carolina Larsen
Hej Camila!
SvaraRaderaDu har svarat på frågorna tydligt och bra. Du har också diskuterat ditt resultat vilket är bra.
Bra diagram!
Hej Camilla,
SvaraRaderani ser ut att ha fått en bra praparation med bra koncentration och kvot. Det är bra att du kommenterar vilken information ni får av absorbansvärdena, man kan alltså inte säga att man har en ren plasmid trots att absorbansvärdena är förväntade. Elektroforesen är ett bra komplement till absorbansmätningen, där ni ju kan se om ni har andra nukleinsyror med..
Annica
Hej Camilla,
SvaraRaderaFrågorna är bra besvarade och du har även bra förklarat vad det är vi ser på bilden av din kurva. Bra att du förklarar att det är DNA som absorberar vid 280 nm och att det inte visar vilken sorts DNA (eller RNA) som vi har i vårat provrör.
//Sophie