Dag 2 - PCR, gelelektrofores och klyvning av plasmid-DNA

Onsdagens laboration gick ut på att med hjälp av PCR amplifiera det insert av pLL37 som förhoppningsvis fanns i de plasmider som renades fram under föregående laboration, och sedan kontrollera detta med en gelelektrofores. Till sist skulle en del av plasmiderna från den ursprungliga plasmidlösningen klyvas, som förberedelse inför nästa laboration. Klyvningslösningen förvaras i frys till nästa laborationstillfälle. Resten av den agarosgel som tillverkades till elektroforesen sparas också till nästa vecka.

¨

Agarosgelen, som elektroforesen utförts i, studerades i UV-ljus och fotograferades. Resultatet kan skådas nedan:

Fotografi av gelen

Den negativa kontrollen (PCR-neg. på fotot), där templatet är utbytt mot vatten, uppvisar endast ett diffust märke långt ned på gelen (syns inte så bra på fotot). Detta är med stor sannolikhet primrarna från master mixen, som i denna lösning inte haft ett templat att binda till. I övrigt uppvisas inga band, vilket innebär att det inte skett någon carry over-kontamination.

Den positiva kontrollen (PCR-pos. på fotot) innehåller LL37-genen och används för att kontrollera att PCR:en lyckats. I vårt fall kan man även med hjälp av denna dra slutsatsen att pLL37 fanns i plasmiderna och har amplifierats, då den positiva kontrollen och vår provlösning (PCR-prov på fotot) uppvisar band på ungefär samma plats. PCR-produkterna i vårt prov är dock något kortare än den fullskaliga LL37-genen på grund av primerhybridiseringen - därför uppvisas bandet för vårt amplifikat något längre ned än det för den positiva kontrollen.



Även om vi i jämförelse med den positiva kontrollen kan säga att vårt prov bör innehålla amplifikat av pLL37, hade det varit bra att även kunna jämföra med markörer. Två markörer användes (M-III och M-VI), men ingen av dem blev tydlig nog. En högre koncentration hade varit önskvärd. Markörerna borde ha sett ut enligt följande:


Markör III respektive markör VI

Amplifikatet ska vara ca 550 baspar, och hade vi haft tydliga markörer hade vi kunnat konstatera dess faktiska storlek.

I en av brunnarna hade vi även vår ursprungliga, renade, plasmidlösning (oklyvd plasmid på fotot). Banden som denna ger upphov till kan inte jämföras med ovanstående markörer, då plasmiderna inte är linjära. Det starkaste bandet visar plasmider i sin ursprungliga form - med supercoilstruktur. Ovanför detta band hittar vi dock även ytterligare två band. Dessa visar att en del av plasmiderna gått sönder; vissa har fått ett enkelsträngat brott och blivit open circular, medan andra gått sönder i båda strängarna och vecklats upp till en mer linjär struktur. Dessa två formförändringar gör att plasmiderna ej kan vandra lika lätt genom gelen, och de ger därför upphov till band längre upp. Det hela tyder på att vi vid något/några steg varit lite väl hårdhänta med plasmiderna...

Vårt prov (PCR-prov på fotot) uppvisar även ett diffust band längre upp på gelen än var amplifikatet befinner sig. Detta bör vara rester av templatet.

Nu till en fråga; hur i hela friden får man två bilder att ligga intill varandra i den här inläggsredigeraren? :(