Dag 3 och 4 - Southern med probetillverkning och detektion av LL37

 Så är vi till sist framme vid laborationens två sista dagar. Då utfördes först en gelelektrofores på den klyvda plasmidlösningen från förra veckan, varefter de resulterande DNA-banden överfördes till ett nylonmembran i en Southern blot. En probe märkt med DIG-dUTP tillverkades genom random priming och hybridiserades till vad som förhoppningsvis var pLL37 på membranet. Detektion skedde sedan med hjälp av tillsats av NBT och BCIP som substrat.


Alina klipper ut membran och Watmanpapper



Elektrofores





  









Southern blot



Fotografi av gelen                             Fotografi av membranet


Först av allt vill jag bara säga att markörerna blev mycket bättre den här gången, med tydliga band. Det är fortfarande något knepigt att bestämma vilket band som är vilket i jämförelse med de bilder på markörerna vi hade (jag orkar inte kämpa med att få bilderna att ligga på plats längre, men markörbilden finns ju att titta på i föregående inlägg). Om vi tittar på klyvningslösningen med högst koncentration (0,5 µg) och jämför den med markör VI (M-VI), ser vi att den ligger i ungefärlig höjd med vad jag gissar är M-VI:ans 653 bp-band. LL37-genen ska vara strax över 600 bp, så detta bör stämma.

I klyvningsprodukternas vandringsbana ser vi även ett starkt band mycket tidigare på gelen. Jag antar att detta är ofullständigt kluvna plasmider. Vad gäller den oklyvda plasmidlösningen så ser vi samma resultat som förut - ett starkt band för plasmiden i supercoilstruktur samt två mer diffusa band en bit längre upp på gelen, vilka bör vara plasmiden i open circular och linjär struktur. Vi ser även skymtar av dessa i den klyvda lösningen.

Så tar vi oss även en titt på nylonmembranet. På membranet är det meningen att vi ska kunna se alla de sekvenser där proben bundit. Det vill säga, vi borde se alla de sekvenser som innehåller LL37-genen. Detta inkluderar förstås vår klyvningsprodukt, men också den oklyvda plasmiden i alla dess former (denna har ju kvar sitt insert - pLL37). Vi kan även slå fast att de övriga banden i klyvningslösningens bana faktiskt var ofullständigt kluvna plasmider, då dessa också ger upphov till starka band. Proben har dock också bundit lite oönskat och ospecifikt till markör VI (M-VI); där ser vi en svag fällning.

Något som vi inte kunde se på gelen, var band för klyvningslösningen med lägst koncentration (0,005 µg). Detta kan vi dock se på membranet, vilket säger oss att denna detektionsmetod är mycket känslig. Det är en av fördelarna med Southern blot jämfört med elektrofores efter PCR - Southern är känsligare. En nackdel med Southern är att det ingår så många olika steg och tar väldigt lång tid (med hybridisering över natt som ett exempel), och har någonting då gått snett på vägen upptäcks det inte förrän under detektionen (eller på gelen från elektroforesen, beroende på vad felet är) och allt har varit förgäves. En nackdel med PCR är den stora risken för kontamination. Om DNA från ett annat prov kommer ner i det egna provet innan amplifieringen, så amplifieras även detta.

Nu börjar jag bli trött på det här, så det är dags att börja runda av och avsluta. Som säkert många andra också säger, så har det här varit en mycket lärorik laboration och ett ypperligt (inte ofta man får använda det ordet) tillfälle att bara få in lite mer labbvana. Jag tycker nog att det allra, allra bästa var att jag fick tillfälle att inte bara en gång, utan två gånger få öva på elektrofores. I våras fick jag aldrig göra detta, och det är lite pillrigt att ladda brunnarna... Så något mer som var bra var att det båda gångerna fanns utrymme på gelen (både för mig och Alina) att testladda en brunn med loading buffer - under båda testerna jag gjorde lyckades jag förstöra brunnen, men med våra faktiska prover så gick det galant. Vissa moment på labb får vi bara möjlighet att göra en enda gång - då fastnar det inte.

Nu tackar jag för mig, och ska gå och kommentera lite bloggar.