Dag 3 och 4 - Southern med probetillverkning och detektion av LL37

 Så är vi till sist framme vid laborationens två sista dagar. Då utfördes först en gelelektrofores på den klyvda plasmidlösningen från förra veckan, varefter de resulterande DNA-banden överfördes till ett nylonmembran i en Southern blot. En probe märkt med DIG-dUTP tillverkades genom random priming och hybridiserades till vad som förhoppningsvis var pLL37 på membranet. Detektion skedde sedan med hjälp av tillsats av NBT och BCIP som substrat.


Alina klipper ut membran och Watmanpapper



Elektrofores





  









Southern blot



Fotografi av gelen                             Fotografi av membranet


Först av allt vill jag bara säga att markörerna blev mycket bättre den här gången, med tydliga band. Det är fortfarande något knepigt att bestämma vilket band som är vilket i jämförelse med de bilder på markörerna vi hade (jag orkar inte kämpa med att få bilderna att ligga på plats längre, men markörbilden finns ju att titta på i föregående inlägg). Om vi tittar på klyvningslösningen med högst koncentration (0,5 µg) och jämför den med markör VI (M-VI), ser vi att den ligger i ungefärlig höjd med vad jag gissar är M-VI:ans 653 bp-band. LL37-genen ska vara strax över 600 bp, så detta bör stämma.

I klyvningsprodukternas vandringsbana ser vi även ett starkt band mycket tidigare på gelen. Jag antar att detta är ofullständigt kluvna plasmider. Vad gäller den oklyvda plasmidlösningen så ser vi samma resultat som förut - ett starkt band för plasmiden i supercoilstruktur samt två mer diffusa band en bit längre upp på gelen, vilka bör vara plasmiden i open circular och linjär struktur. Vi ser även skymtar av dessa i den klyvda lösningen.

Så tar vi oss även en titt på nylonmembranet. På membranet är det meningen att vi ska kunna se alla de sekvenser där proben bundit. Det vill säga, vi borde se alla de sekvenser som innehåller LL37-genen. Detta inkluderar förstås vår klyvningsprodukt, men också den oklyvda plasmiden i alla dess former (denna har ju kvar sitt insert - pLL37). Vi kan även slå fast att de övriga banden i klyvningslösningens bana faktiskt var ofullständigt kluvna plasmider, då dessa också ger upphov till starka band. Proben har dock också bundit lite oönskat och ospecifikt till markör VI (M-VI); där ser vi en svag fällning.

Något som vi inte kunde se på gelen, var band för klyvningslösningen med lägst koncentration (0,005 µg). Detta kan vi dock se på membranet, vilket säger oss att denna detektionsmetod är mycket känslig. Det är en av fördelarna med Southern blot jämfört med elektrofores efter PCR - Southern är känsligare. En nackdel med Southern är att det ingår så många olika steg och tar väldigt lång tid (med hybridisering över natt som ett exempel), och har någonting då gått snett på vägen upptäcks det inte förrän under detektionen (eller på gelen från elektroforesen, beroende på vad felet är) och allt har varit förgäves. En nackdel med PCR är den stora risken för kontamination. Om DNA från ett annat prov kommer ner i det egna provet innan amplifieringen, så amplifieras även detta.

Nu börjar jag bli trött på det här, så det är dags att börja runda av och avsluta. Som säkert många andra också säger, så har det här varit en mycket lärorik laboration och ett ypperligt (inte ofta man får använda det ordet) tillfälle att bara få in lite mer labbvana. Jag tycker nog att det allra, allra bästa var att jag fick tillfälle att inte bara en gång, utan två gånger få öva på elektrofores. I våras fick jag aldrig göra detta, och det är lite pillrigt att ladda brunnarna... Så något mer som var bra var att det båda gångerna fanns utrymme på gelen (både för mig och Alina) att testladda en brunn med loading buffer - under båda testerna jag gjorde lyckades jag förstöra brunnen, men med våra faktiska prover så gick det galant. Vissa moment på labb får vi bara möjlighet att göra en enda gång - då fastnar det inte.

Nu tackar jag för mig, och ska gå och kommentera lite bloggar.

Dag 2 - PCR, gelelektrofores och klyvning av plasmid-DNA

Onsdagens laboration gick ut på att med hjälp av PCR amplifiera det insert av pLL37 som förhoppningsvis fanns i de plasmider som renades fram under föregående laboration, och sedan kontrollera detta med en gelelektrofores. Till sist skulle en del av plasmiderna från den ursprungliga plasmidlösningen klyvas, som förberedelse inför nästa laboration. Klyvningslösningen förvaras i frys till nästa laborationstillfälle. Resten av den agarosgel som tillverkades till elektroforesen sparas också till nästa vecka.

¨

Agarosgelen, som elektroforesen utförts i, studerades i UV-ljus och fotograferades. Resultatet kan skådas nedan:

Fotografi av gelen

Den negativa kontrollen (PCR-neg. på fotot), där templatet är utbytt mot vatten, uppvisar endast ett diffust märke långt ned på gelen (syns inte så bra på fotot). Detta är med stor sannolikhet primrarna från master mixen, som i denna lösning inte haft ett templat att binda till. I övrigt uppvisas inga band, vilket innebär att det inte skett någon carry over-kontamination.

Den positiva kontrollen (PCR-pos. på fotot) innehåller LL37-genen och används för att kontrollera att PCR:en lyckats. I vårt fall kan man även med hjälp av denna dra slutsatsen att pLL37 fanns i plasmiderna och har amplifierats, då den positiva kontrollen och vår provlösning (PCR-prov på fotot) uppvisar band på ungefär samma plats. PCR-produkterna i vårt prov är dock något kortare än den fullskaliga LL37-genen på grund av primerhybridiseringen - därför uppvisas bandet för vårt amplifikat något längre ned än det för den positiva kontrollen.



Även om vi i jämförelse med den positiva kontrollen kan säga att vårt prov bör innehålla amplifikat av pLL37, hade det varit bra att även kunna jämföra med markörer. Två markörer användes (M-III och M-VI), men ingen av dem blev tydlig nog. En högre koncentration hade varit önskvärd. Markörerna borde ha sett ut enligt följande:


Markör III respektive markör VI

Amplifikatet ska vara ca 550 baspar, och hade vi haft tydliga markörer hade vi kunnat konstatera dess faktiska storlek.

I en av brunnarna hade vi även vår ursprungliga, renade, plasmidlösning (oklyvd plasmid på fotot). Banden som denna ger upphov till kan inte jämföras med ovanstående markörer, då plasmiderna inte är linjära. Det starkaste bandet visar plasmider i sin ursprungliga form - med supercoilstruktur. Ovanför detta band hittar vi dock även ytterligare två band. Dessa visar att en del av plasmiderna gått sönder; vissa har fått ett enkelsträngat brott och blivit open circular, medan andra gått sönder i båda strängarna och vecklats upp till en mer linjär struktur. Dessa två formförändringar gör att plasmiderna ej kan vandra lika lätt genom gelen, och de ger därför upphov till band längre upp. Det hela tyder på att vi vid något/några steg varit lite väl hårdhänta med plasmiderna...

Vårt prov (PCR-prov på fotot) uppvisar även ett diffust band längre upp på gelen än var amplifikatet befinner sig. Detta bör vara rester av templatet.

Nu till en fråga; hur i hela friden får man två bilder att ligga intill varandra i den här inläggsredigeraren? :(

Dag 1 - Rening av plasmid-DNA, koncentrations- och renhetsbestämning

Dagens laboration gick ut på att rena plasmider (innehållande pLL37 som insert) från värdbakteriernas övriga cellmaterial. Detta innefattar kromosomalt DNA, RNA, proteiner och övrigt celldebris (t.ex. cellväggen). Reningen innebar en alkalisk denaturering samt rening på glasfiberkolonn.

När plasmidlösningen till slut blivit "ren", testades renheten genom absorbansmätning med spektrofotometer.

Absorbansmaximum för DNA finnes vid 260 nanometer och detsamma för protein finnes vid 280 nanometer. Kvoten mellan dessa värden bör inte understiga 1,8 - gör den det kan en proteinförorening konstateras.

OBS! En kvot som är större än 1,8 betyder dock inte att provet INTE kan innehålla föroreningar av annat än protein, som t.ex. kromosomalt DNA.

Vår (min och Alina del Portos) plasmidlösning gav kvoten:
A260/A280 = 1,83
Sannolikt innehåller då lösningen åtminstone inte några proteinföroreningar!

Med hjälp av absorbansen beräknades även DNA-koncentrationen i plasmidlösningen. En absorbansenhet motsvarar 50 µg/ml, vilket innebär att det värde på absorbansen som vi fått fram kan multipliceras med 50 för att få fram koncentrationen.

A260 = 0,075

c = 0,075 x 50 µg/ml = (0,075 x 50)/1000 µg/µl = 0,00375 µg/µl

Plasmidlösningen var dock spädd 100 gånger med TE-buffert, så detta speglar DNA-koncentrationen i spädningen. Ospädd plasmidlösning har koncentrationen:

c = 0,00375 x 100 µg/µl = 0,375 µg/µl

Har jag missat att ta upp någonting viktigt? :)

test

... test.